Hij was herder en op 15-jarige leeftijd ging hij naar het noviciaat van de kapucijner broeders in Morcone, Italië, waar hij op 19-jarige leeftijd toetrad tot de orde. Hij had verschillende gezondheidsproblemen en op een gegeven moment dacht zijn familie dat hij tuberculose had. Hij werd op 22-jarige leeftijd gewijd op 10 augustus 1910.

Terwijl hij voor een kruis bad, ontving hij op 20 september 1918 de stigmata, de eerste priester ooit die zo gezegend werd. Toen het nieuws zich verspreidde, vooral nadat Amerikaanse soldaten na de Tweede Wereldoorlog verhalen over Pater Pio mee naar huis namen, werd de priester zelf een pelgrimsoord voor zowel vromen als nieuwsgierigen. Hij nam per uur de biecht af. . In 1956 stichtte hij het Huis ter Verlichting van het Lijden, een ziekenhuis waar 60.000 mensen per jaar terecht kunnen. In de jaren 1920 startte hij een reeks gebedsgroepen die vandaag de dag nog steeds bestaan met meer dan 400.000 leden wereldwijd. Hij stierf op 23 september 1968 in San Giovanni Rotondo, Foggia, Italië aan een natuurlijke dood.

Zijn heiligverklaringswonder betrof de genezing van Matteo Pio Colella, 7 jaar oud, de zoon van een dokter die in het Huis ter Verlichting van het Lijden werkte. In de nacht van 20 juni 2000 werd Matteo opgenomen op de intensive care van het ziekenhuis met hersenvliesontsteking. Tegen de ochtend hadden de dokters de hoop voor hem opgegeven omdat negen van de inwendige organen van de jongen geen tekenen van leven meer gaven. Die nacht, tijdens een gebedswake die werd bijgewoond door Matteo's moeder en enkele kapucijner broeders van het klooster van Pater Pio, verbeterde de toestand van het kind plotseling. Toen hij uit de coma ontwaakte, zei Matteo dat hij een oudere man had gezien met een witte baard en een lang, bruin habijt, die tegen hem zei: "Maak je geen zorgen, je zult snel genezen." Het wonder werd goedgekeurd door de Congregatie en paus Johannes Paulus II op 20 december 2001.