Han var herde och vid 15 års ålder gick han in i kapucinernas novisiat i Morcone, Italien, och anslöt sig till orden vid 19 års ålder. Han led av flera hälsoproblem och vid ett tillfälle trodde hans familj att han hade tuberkulos. Han prästvigdes vid 22 års ålder den 10 augusti 1910.

När han bad framför ett kors fick han stigmata den 20 september 1918, den förste präst som någonsin fått en sådan välsignelse. I takt med att ryktet spreds, särskilt efter att amerikanska soldater kom hem med berättelser om Padre Pio efter andra världskriget, blev prästen själv en pilgrimsort för både fromma och nyfikna. Han tog emot biktfäder varje timme. År 1956 grundade han House for the Relief of Suffering, ett sjukhus som tar emot 60.000 patienter per år. På 1920-talet startade han en rad bönegrupper som fortsätter än idag med över 400.000 medlemmar över hela världen. Han dog den 23 september 1968 i San Giovanni Rotondo, Foggia, Italien av naturliga orsaker.

Hans mirakel vid helgonförklaringen var att Matteo Pio Colella, 7 år, son till en läkare som arbetade i huset för lindring av lidande, blev botad. Natten till den 20 juni 2000 lades Matteo in på sjukhusets intensivvårdsavdelning med hjärnhinneinflammation. På morgonen hade läkarna förlorat hoppet om honom eftersom nio av pojkens inre organ hade upphört att ge livstecken. Den natten, under en bönevaka där Matteos mamma och några kapucinerbröder från Padre Pios kloster deltog, förbättrades barnets tillstånd plötsligt. När Matteo vaknade upp ur koman berättade han att han hade sett en äldre man med vitt skägg och en lång, brun dräkt, som sa till honom "Oroa dig inte, du kommer snart att bli botad." Miraklet godkändes av kongregationen och påven S:t Johannes Paulus II den 20 december 2001.