Foi pastor e, aos 15 anos, entrou para o noviciado dos frades capuchinhos em Morcone, Itália, ingressando na ordem aos 19 anos. Teve vários problemas de saúde e, a certa altura, a família pensou que tinha tuberculose. Foi ordenado aos 22 anos, a 10 de agosto de 1910.

Enquanto rezava diante de uma cruz, recebeu os estigmas a 20 de setembro de 1918, sendo o primeiro sacerdote a ser assim abençoado. À medida que a notícia se espalhou, especialmente depois de os soldados americanos terem trazido para casa histórias do Padre Pio após a Segunda Guerra Mundial, o próprio padre tornou-se um ponto de peregrinação tanto para os piedosos como para os curiosos. Ouvia confissões de hora a hora. Em 1956, fundou a Casa para o Alívio do Sofrimento, um hospital que serve 60.000 pessoas por ano. Na década de 1920, iniciou uma série de grupos de oração que continuam até hoje com mais de 400.000 membros em todo o mundo. Morreu a 23 de setembro de 1968 em San Giovanni Rotondo, Foggia, Itália, de causas naturais.

O seu milagre de canonização foi a cura de Matteo Pio Colella, de 7 anos, filho de um médico que trabalhava na Casa para o Alívio do Sofrimento. Na noite de 20 de junho de 2000, Matteo foi internado na unidade de cuidados intensivos do hospital com meningite. De manhã, os médicos tinham perdido a esperança nele, pois nove dos órgãos internos do rapaz tinham deixado de dar sinais de vida. Nessa noite, durante uma vigília de oração em que participaram a mãe de Matteo e alguns frades capuchinhos do mosteiro do Padre Pio, o estado da criança melhorou subitamente. Quando acordou do coma, Matteo disse que tinha visto um homem idoso com barba branca e um longo hábito castanho, que lhe disse "Não te preocupes, em breve estarás curado". O milagre foi aprovado pela Congregação e pelo Papa São João Paulo II a 20 de dezembro de 2001.