Fue pastor y a los 15 años ingresó en el noviciado de los frailes capuchinos de Morcone (Italia), orden a la que ingresó a los 19 años. Sufrió varios problemas de salud, y en un momento dado su familia pensó que tenía tuberculosis. Fue ordenado sacerdote a los 22 años, el 10 de agosto de 1910.

Mientras rezaba ante una cruz, recibió los estigmas el 20 de septiembre de 1918, siendo el primer sacerdote en recibir tal bendición. A medida que se corrió la voz, sobre todo después de que los soldados estadounidenses trajeran a casa historias del Padre Pío tras la Segunda Guerra Mundial, el propio sacerdote se convirtió en punto de peregrinación tanto para piadosos como para curiosos. Escuchaba confesiones por horas... En 1956 fundó la Casa para el Alivio del Sufrimiento, un hospital que atiende a 60.000 personas al año. En los años veinte inició una serie de grupos de oración que continúan hoy con más de 400.000 miembros en todo el mundo. Murió el 23 de septiembre de 1968 en San Giovanni Rotondo, Foggia, Italia, por causas naturales.

Su milagro de canonización consistió en la curación de Matteo Pio Colella, de 7 años, hijo de un médico que trabajaba en la Casa para el Alivio del Sufrimiento. La noche del 20 de junio de 2000, Matteo ingresó en la unidad de cuidados intensivos del hospital con meningitis. Por la mañana, los médicos habían perdido la esperanza en él, ya que nueve de los órganos internos del niño habían dejado de dar señales de vida. Esa noche, durante una vigilia de oración a la que asistieron la madre de Matteo y algunos frailes capuchinos del monasterio del Padre Pío, el estado del niño mejoró repentinamente. Cuando despertó del coma, Matteo dijo que había visto a un anciano con barba blanca y un largo hábito marrón, que le dijo: "No te preocupes, pronto te curarás". El milagro fue aprobado por la Congregación y por el Papa San Juan Pablo II el 20 de diciembre de 2001.